مجید مهدیه

زیست‌فناوری با ترکیب اصول شیمی و زیست‌شناسی در مهندسی، به حوزه‌های مختلفی از جمله ریززیست‌فناوری و ویرایش ژن گسترش ‌یافته است. یکی از امیدوارکننده‌ترین کاربردهای ریززیست‌فناوری در ویرایش ژن، استفاده از نانوذرات به‌عنوان وسیله انتقال برای CRISPR-Cas9 است. CRISPR-Cas9 یک ابزار قدرتمند ویرایش ژن است که به دانشمندان اجازه می‌دهد تغییرات دقیقی در توالی‌های DNA ایجاد کنند. بااین‌حال، یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های آن، تحویل آن به سلول‌های هدف است. از نانوحامل‌ها می‌توان برای محصور کردن CRISPR-Cas9 و تحویل مستقیم آن به سلول‌ها، افزایش کارایی و کاهش off-targets استفاده کرد. سرطان ریه شایع‌ترین سرطان در مردان و دومین سرطان شایع در زنان و همچنین عامل اصلی مرگ ناشی از سرطان است. اگرچه درمان‌های مرسوم هنوز هم اعمال می‌شوند؛ اما خطر بالقوه عود و عوارض جانبی وجود دارد. ازاین‌رو نیاز مبرمی به توسعه یک رویکرد جدید و پیشرفته در قبال این سرطان کشنده وجود دارد. نانولیپوزوم‌ها وزیکول‌های کروی و ریز هستند که می‌توانند برای ژن‌رسانی استفاده شوند. در این پژوهش انتقال توالی کدکننده sgRNA با استفاده از یک نانولیپوزوم به‌عنوان حامل و اثرات آن بر سلول‌های سرطانی ریه بررسی شد. توالی کد کننده sgRNA موردنظر به درون پلاسمید PX458 کلون شد، صحت واردشدن آن پس از PCR توسط ژل الکتروفورز و توالی‌یابی سانجر بررسی شد. سپس نانولیپوزوم‌ها با استفاده از کلسترول و L-α-فسفاتیدیل کولین به روش آبدهی لایه ‌نازک تهیه شدند و با پلاسمید PX458 حاوی توالی کد کننده sgRNA بارگذاری و با استفاده از تکنیک‌های پراکندگی نور دینامیک (DLS)، سنجش پتانسیل زتا مشخصه‌یابی شدند. کارایی کپسولاسیون آن نیز مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت فرایند ترانسفکشن به سلول‌های سرطانی رده A549 انجام و قدرت زیستی سلول‌ها به روش MTT برای 3 گروه شامل: سلول‌های دریافت‌کننده نانولیپوزوم‌های حاوی توالی کد کننده sgRNA، سلول‌های دریافت‌کننده نانولیپوزوم‌های بدون توالی کد کننده sgRNA و سلول‌های بدون دریافت هیچ‌کدام از آن‌ها در سه بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعته بررسی شد. همچنین به‌منظور بررسی و صحت بیان توالی کدکننده توالی کد کننده sgRNAموردنظر، سلول‌های ترانسفکت شده پس از 24 ساعت با میکروسکوپ فلورسنت بررسی شدند. نتایج نشان داد که سایز نانوذرات و شاخص پراکندگی در گروه نانولیپوزوم 224 نانومتر، 301/0 و در گروه نانولیپوزوم به همراه توالی توالی کد کننده sgRNA در حدود 341 نانومتر و 184/0 بوده است. مقدار پتانسیل زتا برابر 36/16 میلی‌ولت اندازه‌گیری شد و کارایی کپسولاسیون 63% محاسبه شد. نتایج تست‌ MTT نشان‌دهنده سمیت پایین سامانه نانولیپوزوم بدون توالی کد کننده sgRNA و قدرت زیستی پایین‌تر گروه نانولیپوزوم به همراه توالی کد کننده sgRNA بود و ترنسفکت سلولی ورود نانولیپوزوم حاوی پلاسمید را با مشاهده GFP زیر میکروسکوپ فلورسنت تأیید کرد. باتوجه‌به نتایج حاصل از روش انتقال ژن CRISPR-Cas9 ارائه شده در این پژوهش، نشان داده شد که توالی کد کننده sgRNA طراحی شده به طور موفق به سلول وارد شده است و می‌توان نتیجه گرفت که انتقال CRISPR-Cas9 به‌وسیله نانولیپوزوم‌ها می‌تواند به‌عنوان یک ابزار قوی، کارساز و ارزان در جهت دست‌کاری ژنتیکی در آزمایشگاه‌های دانشگاهی و مراکز تحقیقاتی و داروسازی مورداستفاده قرار گیرد