حسین محمدی

مقدمه و هدف: بال فرشته یک بدشکلی توسعه یافته بال است که می ‎تواند بر پرورش و تولیدمثل در گله‎ های تجاری اردک تأثیر گذار باشد. از این‎ رو مطالعه تنوع ژنتیکی و شناسایی مناطق ژنومی مؤثر بر صفت بال فرشته ‎ای در جمعیت‎ های اردک، امری ضروری در این گونه محسوب می ‎شود. در این راستا، ابزارهای قدرتمندی مانند نسل جدید توالی‎ یابی امکان رمزگشایی اطلاعات کل ژنوم در این گونه را فراهم آورده است. به‎ طور معمول در مطالعات پویش کل ژنومی در نظر گرفتن تصحیحات سختگیرانه برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب ضروری می‎ باشد، ولی اعمال این نوع تصحیحات موجب از دست رفتن نشانگرهای SNP با اثر کوچکتر مؤثر بر صفات کمّی می‎ گردد که نتیجه آن شناسایی SNP‎هایی می‎ گردد که تنها بخش کوچکی از تنوع ژنتیکی صفت را نشان می‎ دهد و از این‎ رو در اکثر مواقع بخش عمده واریانس ژنتیکی پنهان باقی می‎ ماند. یکی از روش‎ های جایگزین استفاده از آنالیزهای غنی‎ سازی مجموعه‎ های ژنی می‎ باشد. در این روش ارتباط بین صفت مورد مطالعه و نشانگرهای ژنتیکی را در یک دسته یا گروه ژنی که به‎ طور عملکردی با هم مرتبط هستند بررسی می‎ کند. در حقیقت در این روش به‎ دنبال ژن‎ هایی هستیم که به ‎تنهایی اثر آنها بر صفت مورد نظر معنی‎ دار نشده، ولی اثر تجمعی آنها روی صفت دارای اثر معنی ‎دار است. علاوه براین، یکی از دلایل اصلی آنالیز غنی ‎سازی مجموعه‎ های ژنی تعداد کم بودن SNPهای معنی ‎دار می ‎باشد که موجب عدم شناسایی مناطق ژنومی مرتبط با صفات مهم اقتصادی می‎ گردد. در نتیجه روش پویش ژنومی بر مبنای مسیر کارآیی بهتری برای یافتن مناطق ژنومی، درک بهتر مکانیسم و معماری ژنتیکی را دارا می ‎باشد. بنابراین، هدف از پژوهش حاضر شناسایی مناظق ژنومی و ژن‎ های کاندیدای مرتبط با صفت بال فرشته‎ ای در اردک با استفاده از پویش کل ژنوم بر پایه آنالیز مسیر می‎ باشد. مواد و روش ‎ها: بدین‎ منظور از اطلاعات داده ژنوم توالی‎ یابی شده 63 قطعه اردک شامل 30 قطعه دارای بال نرمال (شاهد) و 33 قطعه دارای بال فرشته‎ ای (موردی) استفاده شد. توالی ‎یابی کل ژنوم توسط شرکت ایلومینا Hiseq 4000 انجام شده بود. ابتدا نشانگرهای SNP شناسایی شده از ایندل جدا شدند و با استفاده از برنامه GATK فیلتر شدند. سپس با استفاده از برنامه PLINK، SNPهای دو آللی با حداقل فراوانی آللی بزرگتر یا مساوی با 0/01 که حداقل در 95 درصد افراد دارای ژنوتیپ مشخص بودند، حفظ شده و مابقی حذف شدند. که در نهایت 14064984 نشانگر SNP بعد از مراحل مختلف کنترل کیفیت باقی ماندند. در گام بعدی برای شناسایی SNP‎های مستقل از نرم ‎افزارPLINK استفاده شد. برای این‎ منظور با حذف SNPهایی که در حالت عدم تعادل پیوستگی بالایی با یکدیگر قرار داشتند، در پنجره ‎هایی شامل SNP 50 و با حرکت SNP 5 رو به ‎جلو در هر مرحله، SNPهای دارای r2 (معیار عدم تعادل پیوستگی) بیش از 0/2 (دستور --indep-pairwise 50 5 0.2) با یکدیگر از مجموعه داده ‎ها حذف شدند. در نهایت بعد از کنترل کیفیت تعداد 686449 SNP برای آنالیزهای پویش کل ژنومی بر پایه تجزیه و تحلیل غنی‎ سازی مجموعه ژنی باقی ماندند. اساساً آنالیز پویش ژنومی بر پایه تجزیه و تحلیل مجموعه ‎های ژنی در سه مرحله انجام می ‎گردد: 1) تعیین مکان SNPهای معنی‎ دار با ژن 2) ارتباط ژن‎ ها به طبقات عملکردی و مسیرهای زیستی 3) پویش کل ژنومی بر پایه آنالیز مسیر. 1- تعیین مکان SNPها با ژن‎ ها: SNPهایی که مقدار P-value آنها کمتر از 0/005 بود با استفاده از بسته نرم ‎افزاری biomaRt2 در محیط R و با استفاده از رفرانس ژنومی اردک (CAU_duck1.0) به ژن‎ هایی که نشانگر SNP موردنظر در داخل آن ژن و یا kb 15 بالادست یا پایین‎ دست آن ژن قرار داشت، ارتباط داده شدند. 2- ارتباط ژن‎ ها به طبقات عملکردی و مسیرهای بیوشیمیایی: جهت تعیین طبقات عملکردی ژنی و مسیرهای متابولیکی و تنظیمی ژن‎ های معنی‎ دار از 5 پایگاه ‎های اطلاعاتی شامل هستی‎ شناسی ژن (http://www.geneontology.org/GO, )، مسیرهای بیوشیمیایی (http://www.genome.jp/kegg/KEGG, )، Panther (http://www.pantherdb.org)، Metacyc (http://www.metacyc.org) و Reactome (http://www.reactome.org) جهت تعیین طبقات عملکردی و مسیرهای بیوشیمیایی استفاده گردید. 3- پویش کل ژنومی بر پایه آنالیز مسیر: ارتباط‎ های معنی‎ دار مسیرهای عملکردی با صفت با فرشته‎ ای با استفاده از توزیع فوق هندسی و آماره Fisher’s exact test مورد آزمون قرار گرفت. یافته ‎ها: نتایج آنالیز PCA نشان داد که با PC1 گروه جمعیت سالم و PC2 گروه جمعیت بیمار را به ‎خوبی از یکدیگر تفکیک و جدا کردند. در این پژوهش نشانگرهای تک نوکلئوتیدی واقع روی کروموزوم‎‌‌های 1، 2، 3، 6، 8، 11، 18، 20، 27 و 31 شناسایی شدند که با ژن‌‎های ATP11A، UBE2E2، ITPR2، GUCA1C،ATP2C1، PLCG1 و BMPR1A مرتبط بودند. در تفسیر مجموعه ژنی، تعداد 21 مسیر هستی ‎شناسی ژنی و بیوشیمیایی با صفت بال فرشته ‎ای شناسایی شد (0/05P˂). از این بین، مسیرهای skeletal muscle myosin thick filament assembly، response to calcium ion،wing disc morphogenesis و Calcium signaling pathway عملکرد‌های مهمی را در ارتباط با رشد و توسعه‎ ی عضلات اسکلتی، پاسخ به یون کلسیم، رشد و توسعه استخوان، حجم مواد معدنی استخوان و فعال‎ سازی مسیر سیگنال‎ دهی کلسیم بر عهده داشتند نتیجه ‎گیری: با توجه به نقش کلیدی و مؤثر ژن‎ های کاندیدای شناسایی شده بر صفت بال فرشته‎ ای در این تحقیق، در صورت تأیید به‎ وسیله مطالعات تکمیلی می‎ توان از آنها در انتخاب ژنتیکی گله ­های تجاری اردک مورد استفاده قرار گیرند.